微生物的接種、分離和培養

微生物的接種、分離和培養

一、目的要求

    1、掌握各種分離、接種方法。

    2、掌握無(wú)菌操作基本環(huán)節。

二、實(shí)驗說(shuō)明

    微生物在自然界中呈混雜狀態(tài)存在，要獲得所需菌種，必需從中把它們分離出來(lái)。在保存菌種時(shí)不慎受到到污染也需予以分純。微生物分離和純化的方法很多，但基本原理卻是相似的，即將待分離的樣品進(jìn)行一定的稀釋?zhuān)⑹刮⑸锏?a href="/Article-detail-id-687478.html" title="細胞">細胞（或孢子）盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長(cháng)成一個(gè)個(gè)純種單菌落。然而上述工作又離不開(kāi)接種，即將一種微生物移到另一滅過(guò)菌的培養基上的過(guò)程。

三、實(shí)驗材料

    1、恒溫培養箱。

    2、接種環(huán)、玻璃棒、吸管、酒精燈。

    3、培養基（上次實(shí)驗配制的）。

    4、大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌。

四、方法步驟

（一）接種的操作

   1、斜面接種（接金黃葡萄球菌）

    （1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精揮發(fā)后點(diǎn)燃酒精燈。

    （2）將菌種管和斜面握在左手大姆指和其它四指之間，使斜面和有菌種的一面向上，并處于水平位置。

    （3）先將菌種和斜面的棉塞旋轉一下，以便接種時(shí)便于拔出。

    （4）左手拿接種環(huán)（如握鋼筆一樣），以火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管其余部位也過(guò)火滅菌。

    （5）用右手的無(wú)名指、小指和手掌將菌種管和待接斜面試管的棉花塞或試管帽同時(shí)拔出，然后讓試管口緩緩過(guò)火滅菌（切勿燒過(guò)燙）。

    （6）將灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管內，接種環(huán)在試管內壁或未長(cháng)菌苔的培養基上接觸一下，讓其充分冷卻，然后輕輕刮取少許菌苔，再從菌種管內抽出接種環(huán)。

    （7）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面底部向上作“Z”形來(lái)回密集劃線(xiàn)。有時(shí)也可用接種針僅在培養基的中央拉一條線(xiàn)來(lái)作斜面接種，以便觀(guān)察菌種的生長(cháng)特點(diǎn)。。

    （7）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面底部向上作“Z”形來(lái)回密集劃線(xiàn)。有時(shí)也可用接種針僅在培養基的中央拉一條線(xiàn)來(lái)作斜面接種，以便觀(guān)察菌種的生長(cháng)特點(diǎn)。

    （8）接種完畢后抽出接種環(huán)灼燒管口，塞上棉塞。

    （9）將接種環(huán)燒紅滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。

   2、液體接種

    （1）由斜面培養基接入液體培養基，此法用于觀(guān)察細菌的生長(cháng)特性和生化反應的測定，操作方法與前相同，但使試管口向上斜，以免培養液流出接入菌體后，使接種環(huán)和管內壁磨擦幾下以利洗下環(huán)上菌體。接種后塞好棉塞將試管在手掌中輕輕敲打，使菌體充分分散。

    （2）由液體培養基接種液體培養基，菌種是液體時(shí)，接處除用接種環(huán)外尚用無(wú)菌吸管或滴管。接種時(shí)只需在火焰旁拔出棉塞,將管口通過(guò)火焰,用無(wú)菌吸管吸取菌液注入培養液內,搖勻即可。

   3、平板接種

   將菌在平板上劃線(xiàn)和涂布。

    （1）劃線(xiàn)接種 見(jiàn)分離劃線(xiàn)法。

     （2）涂布接種 用無(wú)菌吸管吸取菌液注入平板后，用滅菌的玻棒在平板表面作均勻涂布。

   4、穿刺接種

    把菌種接種到固體深層培養基中，此法用于嫌氣性細菌接種或為鑒定細菌時(shí)觀(guān)察生理性能用。

    （1）操作方法與上述相同，但所用的接種針應挺直。

    （2）將接種針自培養基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途徑慢慢拔出。

（二）分離的操作方法

   1、稀釋分離法

    通過(guò)不斷稀釋使被分離的樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板與溫度適合溶化了的瓊脂培養基混合，這樣分散的細菌被固定在原處而形成單菌落。

    （1）將大腸桿菌或酵母菌用無(wú)菌水制作菌懸液。

    （2）取若干支無(wú)菌試管，每支內盛9ml無(wú)菌水。

    （3）吸取1ml制備好的菌懸液，置于支含有9ml無(wú)菌水的試管內，這樣就稀釋了10倍，也就是10-2。

    （4）從支試管內（10-2）吸取1ml注入第二支含有無(wú)菌水的試管內，這樣就稀釋了100倍，也就是10-2。

    （5）用同樣方法操作，直至稀釋至10-5-10-6。

    （6）分別精確吸取10-5-10-6各稀釋度菌液0.2ml加入編好號的空無(wú)菌平皿中，同一稀釋度重復做三個(gè)平皿。

    （7）將已溶化并冷卻至45℃的瓊脂培養基倒入上述各平皿內，輕輕旋轉使培養基與菌懸液充分混勻，凝固后倒置于37℃或38℃度恒溫箱中培養24-48小時(shí)，觀(guān)察平板上菌落生長(cháng)和分布情況。

   2、平板劃線(xiàn)分離法

    平板劃線(xiàn)分離法是接種環(huán)在平板培養基表面通過(guò)分區劃線(xiàn)而達到分離微生物的一種方法。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點(diǎn)到線(xiàn)”稀釋而達到分離目的。

    （1）倒平板 溶化牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒平板，水平靜置待凝。

    （2）在酒精燈光焰上灼燒接種環(huán)，待冷，取一接種環(huán)金黃葡萄球菌、大腸桿菌混合菌液。

    （3）左手握瓊脂平板稍抬起皿蓋，同時(shí)靠近火焰周?chē)沂殖纸臃N環(huán)伸入皿內，在平板上一個(gè)區域作之形回劃線(xiàn)，劃線(xiàn)時(shí)例接種環(huán)與平板表面成30-40°角度輕輕接觸，以腕力在表面作輕快的滑動(dòng)，勿使平板表面劃破或嵌進(jìn)增基內。

    （4）灼燒接種杯，以殺滅接種環(huán)上尚殘余的菌液，待冷卻后，再將接種環(huán)伸入皿內，在區域劃過(guò)線(xiàn)的地方稍接觸一下后，轉動(dòng)90°，在第二區域繼續劃線(xiàn)。

    （5）劃畢后再灼燒接種杯，冷卻后用同樣方法在其他區域劃線(xiàn)。

    （6）全部劃線(xiàn)完畢后，在平皿底用特種蠟筆注明菌種、日期、組別、姓名。將整個(gè)培養皿倒置放入恒溫箱培養。

    （7）37℃經(jīng)過(guò)24-48小時(shí)培養后取出觀(guān)察。注意菌落的開(kāi)關(guān)、大小、顏色、邊緣、表面結構、透明度等性狀。

無(wú)菌操作環(huán)節

   （1）接種室應保持清潔，用煤粉酚皂液擦洗臺面及墻壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均應用紫外燈滅菌。定期對接種室作無(wú)菌程度的檢查。

   （2）進(jìn)入接種室前，應先做好個(gè)人衛生工作，在緩沖間內要更換工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只準在接種室內使用。不準穿到其它地方去，并要定期更換、消毒。

   （3）接種的試管、三角并瓶等應做好標記，注明培養基、菌種的名稱(chēng)、日期。移入接種室內的所有物品，均須在緩沖室用70%酒精擦試干凈。

   （4）接種前，雙手用70%酒精或新潔爾消毒，操作過(guò)程不離開(kāi)酒精燈火焰；棉塞不亂放；接種工具使用前后均需火焰滅菌。

   （5）培養箱應經(jīng)常清潔消毒。